活死细菌染色成像试剂盒（荧光显微镜法）

AAT Bioquest的霉光™ 荧光活/死细菌成像试剂盒提供双色荧光分析，通过荧光显微镜观察活细菌和死细菌。霉光™ 520是一种非荧光酯酶底物，可扩散到革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。在被细菌细胞内非特异性酯酶水解后，产生绿色荧光产物并在细菌内积累。相比之下，碘化丙啶是一种红色荧光核酸染色剂，只能穿透膜受损的细菌。所以，用适当的混合光™ 520和碘化丙啶染色，细胞膜完整的活细菌发出绿色荧光，而细胞膜受损的死细菌发出红色荧光。霉菌灯™ 荧光活/死细菌成像试剂盒是一种强大的活/死细菌成像工具。染色细胞可分别通过荧光法（FITC过滤器组）和（TRITC过滤器组）监测活细菌和死细菌。

荧光显微镜

激发488nm/540nm

发射530纳米/620纳米

推荐板黑色墙壁/透明底部

仪表规格FITC/TRITC过滤器

组件


A部分：霉菌光™ 520 1小瓶

B组分：碘化丙啶（100X）1小瓶（100μL）

成分C：分析缓冲液1瓶（10毫升）

D组分：DMSO 1小瓶（100μL）

协议摘要


准备100倍光照™ 520库存解决方案

准备细菌样本

添加myclight™ 520和碘化丙啶

用霉光培养细菌样本™ 520和碘化丙啶在37°C下放置5-10分钟，或在黑暗中室温放置60分钟

使用FITC和TRITC过滤器组通过荧光显微镜分析样品


重要提示

开始实验前，在室温下解冻所有试剂盒组件

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等份，并在制备后储存在-20°C下。避免反复的冻融循环。


霉光™ 520储备溶液（100倍）：

将100µL二甲基亚砜（组分D）添加到MycoLight小瓶中™ 520（A部分）。注：将储备溶液储存在-20°C下，避光，重复冻融循环。

样本实验方案


细菌样品的制备


制备浓度为106至108个细胞/毫升的细菌样品。在适当的培养基中将细菌培养到对数后期。注：在波长=600 nm（OD600）处测量细菌培养物的光密度，以确定细胞数。对于大肠杆菌培养，OD600=1.0等于8 x 108个细胞/ml。


通过在10000 x g下离心10分钟移除培养基，并将颗粒重新悬浮在分析缓冲液（成分C）中。


用70%乙醇处理30分钟，然后煮沸60分钟，即可制备死细菌。


染色方案


以下是建议的方案，应根据不同菌株或其他特定需求进行优化。如果观察到较高的背景，可以在成像前添加可选的清洗步骤。


添加1µL的100倍霉光™ 520储备溶液和1µL 100X碘化丙啶（组分B）至100µL分析缓冲液中的细菌样品。


充分混合，在37°C的温度下在黑暗中培养5-10分钟，或在室温下培养60分钟，以获得最佳染色效果。


用荧光显微镜通过FITC（Ex/Em=488/530 nm）和TRITC（Ex/Em=540/620 nm）通道监测细菌的荧光。