细胞和易裂解组织首先在含有异硫氰酸胍的高变性Buffer RLT Plus中裂解和匀质化，该缓冲液能使RNases立即失活，以保证分离到完整的RNA。裂解液再流过gDNA Eliminator柱。该离心柱与高盐缓冲液共同作用，可选择性高效的去除基因组DNA。加入乙醇以提供RNA结合的合适条件，样本再加入到 RNeasy Mini离心柱。含有硅胶膜的特制离心柱能特异性的结合裂解细胞中的RNA。

可从多达10⁷个细胞或30 mg组织中纯化总RNA。简洁的工作流程可在25分钟内纯化得到已去除基因组DNA的RNA（参见RNeasy Plus procedure ）。样本首先被裂解和匀质化。裂解液流过gDNA Eliminator柱，在流过gDNA Eliminator柱的溶液中加入乙醇，样本再加上样到RNeasy Mini离心柱。RNA结合到膜上，污染物被洗去。获得高品质RNA，洗脱体积30 µl或更大。

处理不同的起始样本可用不同的实验方案。实验方案的不同之处主要在于样本的裂解和匀质化。样本上样到gDNA Eliminator柱之后的步骤就类似。此操作流程适合富集mRNA，不包括大部分小于200 nt的RNAs（如rRNAs和tRNAs）。 RNeasy Plus操作流程稍作修改后可从培养细胞中纯化含miRNA等小RNAs的总RNA。

使用Buffer RLT Plus（RNeasy Plus Mini Kit提供）进行组织破碎和匀质化时，可能会产生过多泡沫。在破碎和匀浆前向Buffer RLT Plus中加入Reagent DX（单独提供）可充分减少泡沫产生。Reagent DX经仔细检测，表明配合此试剂盒使用不会影响RNA的纯度或下游应用。

RNeasy Plus Mini Kit纯化得到的RNA适合对少量DNA敏感的下游应用，如定量real-time RT-PCR。纯化得到的RNA还可以用于其他应用。